Source:- https://medicowiki.com/2017/11/29/flow-cytometry/
November 29, 2017adminHematology, Trivia Comments Offon การตรวจแยกเซลล์ด้วยวิธี Flow Cytometry
แพทย์และนักเรียนแพทย์หลายคนที่มีโอกาสได้ดูแลผู้ป่วยที่เป็นโรคของระบบเลือดเช่น โรคมะเร็งต่อมน้ำเหลือง (lymphoma) และโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว (leukemia) อาจจะสังเกตเห็นว่าในปัจจุบันเรามีการตรวจเพิ่มเติมทางห้องปฏิบัติการหลายอย่างเพื่อการวินิจฉัยและเลือกวิธีการรักษาเช่นการตรวจดูลักษณะของเซลล์ที่ดูดมาได้จากไขกระดูก (bone marrow examination) ตรวจชิ้นเนื้อของไขกระดูก (bone marrow biopsy pathology) การตรวจ immunohistochemistry, flow cytometry ไปจนถึง cytogenetics เคยสงสัยกันไหมครับว่า การตรวจต่าง ๆ ที่มากมายชวนสับสนนี้มีประโยชน์อะไรและนำไปใช้ทำอะไรกันบ้างวันนี้หยิบยกเอาเรื่องของการตรวจ flow cytometry มาฝากกันนะครับ
หลักการของการตรวจ flow cytometry
การตรวจ flow cytometry เป็นวิธีการตรวจที่ใช้แยกเซลล์ชนิดต่าง ๆ ที่อยู่ปะปนรวมกันอยู่ในสิ่งส่งตรวจ เช่นเลือด หรือไขกระดูกที่ดูดออกมาได้ (bone marrow aspirates) ซึ่งมีทั้งเซลล์เม็ดเลือดแดง และเม็ดเลือดขาวชนิดต่าง ๆ ปะปนอยู่ด้วยกันเพื่อให้เราทราบว่าในสิ่งส่งตรวจนั้นมีเซลล์ชนิดใดอยู่ในนั้นบ้าง โดยอาศัยลักษณะที่สำคัญของเซลล์ 3 อย่างคือ
- ขนาด
- รูปร่างและความซับซ้อนของโครงสร้างภายในเซลล์
- ชนิดของโปรตีนต่าง ๆ ที่บรรจุอยู่ในเซลล์
ส่วนประกอบต่าง ๆ ที่ใช้ในการตรวจด้วยวิธีนี้มีดังนี้ครับ
- ท่อทรงกระบอกที่บรรจุสิ่งส่งตรวจและนำเซลล์เข้าจุดตรวจด้วยเลเซอร์
- แหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์ที่ใช้ยิงผ่านเซลล์ที่ทำการตรวจ
- ฉากรับแสงเลเซอร์ที่กระจายออกจากแนวตรงเมื่อทะลุผ่านเซลล์ (forward scatter detector)
- ฉากรับแสงเลเซอร์ที่กระจายออกทางด้านข้างเมื่อกระทบถูกเซลล์ (side scatter detector)
- ช่องรับแสงสีต่าง ๆ ที่กระจายเรืองแสงออกมาในระหว่างโดยแสงเลเซอร์กระทบ (fluorescence channels)
- คอมพิวเตอร์ประมวลผล
ขั้นตอนการทำงานของเครื่องตรวจ flow cytometry มีดังนีี้ครับ
- เมื่อนำสิ่งส่งตรวจที่เข้าสู่เครื่องตรวจ เครื่องจะดูดสิ่งส่งตรวจเข้าไปในท่อทรงกระบอก โดยในท่อนี้จะมีลักษณะเป็นทรงกระบอก ตรงปลายสอบเข้าหากันเป็นเหมือนกรวย รอบ ๆ ท่อจะมีน้ำเกลือไหลผ่านตลอดเวลา เมื่อสิ่งส่งตรวจผ่านมาตามท่อแล้วร่วงลงในกรวย จะถูกน้ำเกลือที่อยู่รอบ ๆ บังคับดันให้เซลล์สามารถผ่านเข้าไปตรงทางออกได้ทีละ 1 เซลล์เท่านั้น เรียกได้ว่าเป็นการบังคับเข้าแถวตอนเรียงหนึ่งนั่นเอง
- เมื่อเซลล์ผ่านออกจากท่อ ก็จะเข้าไปยังจุดตรวจด้วยเลเซอร์ ซึ่งที่จุดนี้จะมีแสงเลเซอร์ยิงผ่านตลอด เมื่อเซลล์ถูกแสงเลเซอร์ตกกระทบ ส่วนหนึ่งก็จะทะลุผ่านไป ส่วนหนึ่งก็จะหักเหออกจากทิศทางเดิมบ้างแต่ยังคงมีทิศทางไปข้างหน้า และมีบางส่วนที่หักเหออกไปด้านข้างหรือสะท้อน ส่วนที่ทะลุผ่านและหักเหเพียงเล็กน้อย เรียกว่า forward scatter ส่วนที่หักเหไปทางด้านข้างหรือสะท้อน ก็เรียกว่า side scatter
- ลำแสงที่ทะลุและหักเหต่าง ๆ จะไปตกกระทบกับฉากที่รออยู่ ประมาณของลำแสงที่ตกกระทบ จะถูกเปลี่ยนเป็นสัญญาณทางไฟฟ้า มากน้อยแตกต่างกันไปตามลักษณะของเซลล์ โดยที่ ประมาณลำแสงที่เป็น forward scatter จะขึ้นอยู่กับขนาดของเซลล์ (ยิ่งปริมาณมากขนาดก็ใหญ่) และปริมาณลำแสงที่เป็น side scatter จะขึ้นอยู่กับส่วนประกอบและความซับซ้อนของโครงสร้างภายในเซลล์ (ยิ่งมาก แสดงว่าโครงสร้างซับซ้อนมาก)
- ข้อมูลสัญญาณทางไฟฟ้าอันนี้ จะถูกส่งไปเก็บเป็นข้อมูลในคอมพิวเตอร์ ซึ่งจะได้ข้อมูลเกี่ยวกับขนาดและความซับซ้อนของโครงสร้างเซลล์แต่ละเซลล์ที่พึ่งถูกตรวจไป รวมถึงทราบด้วยว่าในสิ่งส่งตรวจนั้นมีเซลล์แต่ละชนิดนั้นอยู่มากน้อยเท่าใดด้วย
ตัวอย่างที่แสดงให้ดู จะเห็นว่ามีกราฟขึ้นมา 2 ชุด คือกราฟที่แยกชนิดเซลล์ตามขนาด และกราฟที่แยกชนิดเซลล์ตามโครงสร้างภายในเซลล์ เอาข้อมูลคู่นี้มาจับก็จะแยกได้ว่าเซลล์ใดเป็นชนิดใด เช่น เม็ดเลือดแดงขนาดใหญ่หน่อย ไม่ซับซ้อน lymphocyte ขนาดเล็กไม่ค่อยซับซ้อน monocyte ขนาดใหญ่ขึ้นมาหน่อย ซับซ้อนปานกลาง และกลุ่ม polymorphonuclear cell ขนาดใหญ่และซับซ้อนเป็นต้นเอ๊ะ…ถ้าจะทำแค่นี้ ดู slide blood smear ด้วยกล้องจุลทรรศน์ก็พอไหม?เครื่องนี้มีดีกว่านั้นอีกหน่อยครับ จุดขายมันอยู่ที่ fluorophor และ fluorescence ครับที่นี้ถ้าเราต้องการรู้ว่า ในกลุ่มเซลล์นั้น ๆ มีชนิดเซลล์ย่อยอะไรอยู่บ้าง เราก็สามารถเลือกตรวจโดยการใส่สาร antibody ที่จำเพาะกับโปรตีนในเซลล์ชนิดที่เราสนใจลงไป โดย antibody ที่เราเตรียมไว้นี้ ติดสีเอาเรืองแสง (fluorophor) เอาไว้ด้วย เมื่อ antibody ที่เราใส่เข้าไป จับเข้ากับโปรตีนในเซลล์แล้ว เราก็นำเอาสิ่งส่งตรวจที่เตรียมไว้ไปเข้าเครื่องตรวจเมื่อเซลล์ที่มี protein ชนิดนั้น ๆ ที่เราสนใจอยู่ผ่านเข้าไปที่จุดตรวจ แสงเลเซอร์จะไปกระทบกับ fluorophor ที่เราติดไว้ ทำให้เกิดเป็นแสงเรืองขึ้นมาโดยมีสีเฉพาะ เครื่องก็จะตรวจจับได้ว่าแสงสีนี้มีอยู่ปริมาณมากน้อยเพียงใด ก็จะสามารถบอกได้แล้วครับว่า มีเซลล์ที่เราสนใจอยู่หรือไม่ มากน้อยแค่ไหนครับโปรตีนที่มักจะเป็นเป้าหมายของการค้นหาชนิดเซลล์ที่เราอาจจะได้มีโอกาสเห็นกันได้บ่อย ๆ ก็เช่นโปรตีนในกลุ่ม cluster of differentiation (CD) นั่นเองครับ สงสัยไหมครับมันคืออะไรCluster of differentiation คือกลุ่มของโปรตีนบนผิวเซลล์ที่จะปรากฏขึ้นหรือเปลี่ยนแปลงไปเมื่อเซลล์ตัวอ่อนมีการพัฒนาเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดใดชนิดหนึ่งโดยเฉพาะ โดยเมื่อเริ่มต้นเป็นเซลล์อ่อน อาจมีโปรตีนชนิดหนึ่งปรากฏอยู่ (เช่น CD45) เมื่อเซลล์นี้โตขึ้นและถูกควบคุมโดยยีนให้พัฒนาไปเป็นเม็ดเลือดขาวชนิด T-lymphocyte ก็จะมี CD3 ปรากฏขึ้น และเมื่อพัฒนาในขั้นต่อ ๆ ไป ก็จะมีโปรตีนชนิดอื่น ๆ เกิดขึ้นตามมาอีก เช่นถ้าปลายทางเป็น Helper T-lymphocyte ก็จะมี CD45, CD3 อยู่ก่อนและมี CD4 มาเพิ่มอีก หรือถ้าปลายทางโตขึ้นไปเป็น cytotoxic T-lymphocyte ก็จะมี CD45, CD3 และ CD8 ดังนี้เป็นต้น
Cluster of differentiation (ภาพจาก wikipedia.org)เอาไปใช้ประโยชน์ยังไง?กรณีผู้ป่วยรายหนึ่งป่วยด้วยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว ก็จะมีเซลล์เม็ดเลือดขาวตัวอ่อน (ที่เราเรียกว่า blasts) โผล่ออกมามากมาย ตัวอ่อนเหล่านี้อาจกำลังอยู่ในระหว่างการเจริญพัฒนาไปเป็นเซลล์ในกลุ่ม lymphocytes ที่เรียกว่า lymphoid series หรือเป็นกลุ่ม polymorphonuclear cells ที่เรียกว่า myeloid series ก็ได้ ซึ่งการรักษาและแนวโน้มในการตอบสนองต่อการรักษาจะแตกต่างกัน เราจึงต้องพยายามแยกว่า เซลล์ที่ผู้ป่วยมีอยู่นั้น เป็นแบบไหนแน่เราก็ใช้ flow cytometry ค้นหากันเลยครับ (ตารางนี้เป็นเพียงตัวอย่างบางส่วนเท่านั้นนะครับ)
| Type of cell | CD markers |
| stem cells | CD34+, CD31-, CD117 |
| all leukocyte groups | CD45+ |
| Granulocyte | CD45+, CD11b, CD15+, CD24+, CD114+, CD182+ |
| Monocyte | CD4, CD45+, CD14+, CD114+, CD11a, CD11b, CD91+, CD16+ |
| T lymphocyte | CD45+, CD3+ |
| T helper cell | CD45+, CD3+, CD4+ |
| T regulatory cell | CD4, CD25, FOXP3 (a transcription factor) |
| Cytotoxic T cell | CD45+, CD3+, CD8+ |
| B lymphocyte | CD45+, CD19+, CD20+, CD24+, CD38, CD22 |
| Thrombocyte | CD45+, CD61+ |
| Natural killer cell | CD16+, CD56+, CD3-, CD31, CD30, CD38 |
ถ้าเราลองใส่ antibody เพื่อค้นหา CD ชนิดต่าง ๆ แล้วไปตรวจ flow cytometry และพบว่าตัวอย่างที่ส่งตรวจมีเซลล์ที่ติดสีของ CD34+, CD45+, CD24+, CD114+ ก็ยอกได้ว่าเป็น myeloid series ถ้าเจอ CD45+, CD19+, CD20+ ก็บอกได้ว่าเป็น lymphoid series เป็นต้นนั่นเองครับโอกาสต่อ ๆ จะเอาตัวอย่างผู้ป่วยจริงที่ทำการส่งตรวจ flow cytometry มาเล่าให้ฟังกันครับ